في أواخر الثمانينيات ، كما هو متقدم ومع ذلك ، فإن الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر به عيب كبير: الفتحة متحد البؤر لا تحجب التألق المتولد خارج النقطة المحورية فحسب ، بل تمنع أيضًا التألق الناتج عن النقطة البؤرية المنتشرة بواسطة الأنسجة البيولوجية ، مما أدى إلى انخفاض في كفاءة جمع الفلورة ، ولا يمكن أن يزيد عمق التصوير عن 100 ميكرومتر. لذلك ، في التسعينيات ، ظهر الفحص المجهري ثنائي الفوتون الذي يجمع بين الفحص المجهري متحد البؤر بالليزر وتقنية الإثارة ثنائية الفوتون. يتم تحديد الطول الموجي المثير لعملية امتصاص الفوتونين بشكل عام في نطاق النافذة الحيوية الضوئية 680-1080 نانومتر ، والذي يتجنب تلف الضوء فوق البنفسجي للخلايا أو الكائنات الحية ويخترق بشكل أعمق.
حاليًا ، أكثر مجهر تألق ثنائي الفوتون استخدامًا هو ليزر أحجار التيتانيوم المصنوعة من التيتانيوم ، وهو ضخم ومكلف ، مما يحد من تطبيق الفحص المجهري ثنائي الفوتون في مجالات مختلفة مثل علوم الحياة والكيمياء والطب. لذلك في بعض المجالات مثل التشخيص الطبي ، حاول الناس استخدام ليزر الحالة الصلبة صغير الحجم وبأسعار معقولة تحت نانوثانية كمصدر قياسي للضوء.
المبدأ الأساسي للإثارة ثنائية الفوتون هو أنه عندما يكون جزيء الفلورسنت متحمسًا تحت كثافة الفوتون العالية ، فإنه يمتص في نفس الوقت فوتونين طويلي الطول الموجي ، ثم يشع تلقائيًا فوتونات فلورية إلى الحالة الأرضية بعد قفزات الإثارة وعمليات الاسترخاء. بالمقارنة مع الفحص المجهري التقليدي للإثارة أحادية الفوتون ، فإن توليد الإشارة الضوئية في مجهر مضان الإثارة ثنائي الفوتون يكون غير خطي ، مع كون ضوء الإثارة ذو طول موجي أطول ، ومصدر ضوء ذو طاقة أعلى ، والفوتونات الفلورية المنبعثة لها طول موجي أطول بقليل من نصف الطول الموجي للإثارة.
يستخدم الفحص المجهري ثنائي الفوتون مصدر ضوء ليزر قريب من الأشعة تحت الحمراء ، وطبيعته غير الخطية لا تتطلب فتحة متحد البؤر. لذلك ، بالمقارنة مع الفحص المجهري متحد البؤر ، فإن الفحص المجهري ثنائي الفوتون له المزايا التالية:
- عمق تصوير كبير وضرر بصري منخفض ؛
- لا حاجة إلى فتحة متحد البؤر ، وتحسين كفاءة جمع التألق بشكل كبير ؛
- دقة وتباين مكاني أعلى ؛
- نطاق إثارة صغير ، سمية ضوئية صغيرة وتبييض ؛
- أطوال موجات الانبعاث والإثارة متباعدة ، متجنبة التداخل الطيفي ؛
